Быстрое выявление ОРВИ

Nov 14, 2023

Nature Biomedical Engineering, том 6, страницы 944–956 (2022 г.) Процитировать эту статью

13 тысяч доступов

23 цитаты

64 Альтметрика

Подробности о метриках

Быстрое тестирование нуклеиновых кислот занимает центральное место в эпиднадзоре за инфекционными заболеваниями. Здесь мы сообщаем об анализе быстрого тестирования на COVID-19 и его реализации в прототипе микрофлюидного устройства. Анализ, который мы назвали DISCoVER (для диагностики с ферментативным отчетом о коронавирусе), включает в себя лизис образцов без экстракции с помощью стабильных при хранении и недорогих реагентов, мультиплексную изотермическую амплификацию РНК с последующей транскрипцией T7 и Cas13-опосредованное расщепление погашенного флуорофора. . Устройство состоит из одноразового микрофлюидного картриджа с гравитационным приводом, вставленного в компактный прибор для автоматического проведения анализа и считывания флуоресценции в течение 60 минут. DISCoVER может обнаруживать коронавирус 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2) в слюне с чувствительностью 40 копий мкл–1, при валидации (по сравнению с количественной ПЦР) с использованием тотальной РНК, выделенной из 63 образцов, его чувствительность составляла 94 %, а специфичность — 100 %. образцы мазков из носа (33 SARS-CoV-2-положительных, с пороговыми значениями цикла 13–35). Устройство правильно идентифицировало все протестированные клинические образцы слюны (10 из 13 положительных на SARS-CoV-2, с пороговыми значениями цикла 23–31). Быстрое тестирование нуклеиновых кислот на месте оказания медицинской помощи может расширить использование молекулярной диагностики.

Быстрое обнаружение нуклеиновых кислот на месте оказания медицинской помощи является важнейшим компонентом надежной инфраструктуры тестирования для контроля передачи заболеваний. Такие вспышки, как пандемия коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19), выявили ограничения модели централизованной диагностической лаборатории и длительное время ожидания ответа. Разработанные в лаборатории тесты, такие как количественная полимеразная цепная реакция (кПЦР), проводятся в учреждениях, требующих трудоемкого персонала и инфраструктуры оборудования для отбора образцов, экстракции нуклеиновых кислот, термоциклирования и анализа данных. Время транспортировки образцов и время предоставления результатов также в значительной степени влияют на время выполнения централизованных тестов. Разработка простого в использовании микрофлюидного устройства в сочетании с обнаружением на месте позволит увеличить объем и доступ к быстрому молекулярному тестированию.

На сегодняшний день более 6 миллионов смертей от COVID-19 стали результатом более 500 миллионов случаев заражения его возбудителем, коронавирусом 2 тяжелого острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2). С множеством проблем, связанных с высоким уровнем бессимптомных инфекций1, недостаточным тестированием и узким временным окном для обеспечения высокой чувствительности молекулярных тестов2,3, можно бороться путем широкого внедрения молекулярной диагностики на месте, например, при входе на рабочее место или в класс. Существует также огромный потенциал для тестирования на уровне сообщества для расширения клинических рабочих процессов, когда положительные случаи подтверждаются путем направления на более ограниченное количество тестов клинического уровня. Альтернативные методы отбора проб и технологии тестирования также могут помочь диверсифицировать цепочку поставок диагностических материалов, поскольку стандартный конвейер клинических испытаний может быть ограничен набором для выделения РНК или нехваткой мазков4,5.

Поэтому мы стремились разработать метод, который не требовал бы выделения РНК или мазков из верхних дыхательных путей и мог бы быть интегрирован в быстрый автоматизированный рабочий процесс с использованием микрофлюидной техники. Анализы на основе кПЦР ранее были разработаны с прямым введением образца и обычно используют высокую температуру для лизиса образца6. В других подходах использовались хаотропные агенты, химическое восстановление и ингибиторы РНКазы6,7,8,9. Кроме того, сообщается, что образцы слюны на 97% совпадают с мазками из носоглотки (НП)10,11.

Обнаружение на основе кластерных регулярных коротких палиндромных повторов (CRISPR) является многообещающим новым подходом к диагностике нуклеиновых кислот. Эти методы основаны на зависимой от направляющей РНК активации нуклеаз Cas13 или Cas12 для индукции активности неспецифической одноцепочечной РНК или одноцепочечной ДНК-нуклеазы, соответственно, с целью расщепления и высвобождения клеточной репортерной молекулы12,13,14, 15,16,17,18,19. Выпущенный репортер можно количественно измерить с помощью детектора флуоресценции для считывания результатов теста. Обнаружение на основе CRISPR очень специфично, но одним только нуклеазам Cas13 может потребоваться до 2 часов, чтобы достичь аттомолярной чувствительности для диагностических приложений20,21. Напротив, петлевая изотермическая амплификация (LAMP) обеспечивает высокочувствительную амплификацию нуклеиновых кислот менее чем за 20 минут с аттомолярными пределами обнаружения20 (LOD). Однако, несмотря на чувствительность и скорость LAMP, такие изотермические методы часто склонны к неспецифической амплификации22,23.