Пространство

Oct 12, 2023

Биология связи, том 6, Номер статьи: 173 (2023) Цитировать эту статью

3587 Доступов

1 Цитаты

3 Альтметрика

Подробности о метриках

Биоинженерные и полностью созревшие органоиды человеческого мозга представляют собой очень ценные трехмерные модели, имитирующие мозг in vitro, позволяющие воспроизвести in vivo развитие мозга, нейродегенеративные и нейродегенеративные заболевания. Различные инструктивные сигналы, влияющие на множество биологических процессов, включая морфогенез, стадии развития, переходы судеб клеток, миграцию клеток, функцию стволовых клеток и иммунные реакции, были использованы для создания физиологически функциональных церебральных органоидов. Тем не менее, современные подходы к созреванию требуют улучшения для высокоурожайных и функциональных церебральных органоидов с уменьшенной вариабельностью от партии к партии. Здесь мы демонстрируем два разных инженерных подхода: микрогравитационный биореактор с вращающейся системой культивирования клеток (RCCS) и недавно разработанную микрофлюидную платформу (мк-платформу) для улучшения собираемости, воспроизводимости и выживаемости высококачественных церебральных органоидов и сравнения с таковыми традиционных церебральных органоидов. спиннерные и шейкерные системы. Органоиды RCCS и µ-платформы достигли идеальных размеров, собираемости примерно 95%, продлили время культивирования с Ki-67 + /CD31 + /β-катенин+ пролиферативными, адгезивными и эндотелиоподобными клетками и продемонстрировали обогащенное клеточное разнообразие (обильное нейрональное/глиальное/ популяция эндотелиальных клеток), структурный морфогенез мозга, дальнейшие функциональные особенности нейронов (глутамат-секретирующие глутаматергические, ГАМКергические и гиппокампальные нейроны) и синаптогенез (пресинаптическое-постсинаптическое взаимодействие) в течение всего развития человеческого мозга. Оба органоида экспрессировали микроглию CD11b + /IBA1 + и олигодендроциты MBP + /OLIG2 + на высоких уровнях по состоянию на 60-й день. Органоиды RCCS и µ-платформы, демонстрирующие высокий уровень физиологической точности (высокий уровень физиологической точности), могут служить функциональными доклиническими моделями для тестирования. новые терапевтические схемы лечения неврологических заболеваний и преимущества мультиплексирования.

Понимание процессов генерации, созревания и функционального развития мозга жизненно важно для понимания эволюционного развития мозга, а также для разработки стратегий лечения нейродегенеративных заболеваний и заболеваний, связанных с развитием нервной системы1,2. Хотя модели на животных полезны для механического исследования, повторение развития человеческого мозга значительно ограничено из-за различий на клеточном и молекулярном уровнях3. Более того, большая часть наших текущих знаний о человеческом мозге основана на анализе посмертных или патологических образцов, непригодных для экспериментальных манипуляций4. В последнее время индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК), обладающие способностью непрерывно регенерировать с помощью факторов репрограммирования (OCT4, SOX2, c-MYC и KLF4) и дифференцироваться во все типы клеток в организме, открыли новые возможности для изучения нервной системы человека. развитие5. Благодаря первому протоколу генерации трехмерных церебральных органоидов на основе ИПСК, опубликованному Ланкастером и соавт.6, церебральные органоиды стали революционными благодаря способности самоорганизовываться, формировать более сложные структуры, трансформироваться в различные области-предшественники, имитировать состав/ткань типа клеток. организации эмбрионального мозга и напоминают пространственную структуру мозга7. Кроме того, подобно процессу формирования и развития мозга в эмбриональном периоде, церебральные органоиды могут во многом имитировать человеческий мозг, генерируя эпигеномные и транскрипционные программы, такие как сигналы, связанные с разнообразием клеток, прояснением функциональных синапсов, формированием дендритных отростков и установлением самоактивируемые нейронные сети8,9.

Традиционные подходы к созреванию церебральных органоидов с использованием спиннеров10 и шейкеров11 способствуют организации собственных нейронов и формированию желудочков головного мозга, обеспечивая возбуждение. Однако эти методы имеют серьезные ограничения, в том числе измененную диффузию питательных веществ и апоптотические зоны из-за отсутствия васкуляризации, дефицита иммунных клеток, зависимости от матригеля, низкой воспроизводимости, масштабируемости и высокой вариабельности индуцированных компонентов и клеток мозга12. Для предотвращения этих ограничений были разработаны различные стратегии, такие как совместное культивирование с эндотелиальными клетками пупочных сосудов человека (HUVEC)13 и эндотелиальными клетками, полученными из ИПСК человека, не только для усиления диффузии кислорода/питательных веществ, но также для усиления нейронной дифференцировки, миграции и формирование схемы в процессе разработки14. Другие стратегии направлены на воссоздание клеточной микрофизиологической среды с помощью децеллюляризованного внеклеточного матрикса мозга (ECM)15 или синтетического ECM-подобного матрикса, чтобы способствовать дифференцировке нейронов и глии во время органогенеза мозга16,17. Хотя проблемы низкой воспроизводимости, масштабируемости и высокой изменчивости органоидов головного мозга не решены полностью, их пытались преодолеть с помощью различных платформ «органоид-на-чипе»18,19 или новых биореакторных систем, таких как одноразовые биореакторы с вертикальным колесом20. Несмотря на развитие органоидных технологий, гемодинамические силы, такие как напряжение сдвига, циклическое растяжение и распределение жидкости, регулирующие механочувствительные пути в церебральных органоидах, до сих пор четко не изучены, что является еще одним критическим ограничением. Однако известно, что механочувствительные сигналы, связанные с потоком спинномозговой жидкости во время эмбриогенеза, регулируют важные структурные адаптации, такие как ориентация формы эмбриона с эффектом лево-правой асимметрии, поляризация радиальных глиальных клеток, дифференцировка/функционализация нейральных стволовых клеток. и более поздние события складывания тканей21,22. Таким образом, существует необходимость в разработке платформ с использованием принципов биологии и инженерии, которые смогут имитировать пространственно-временную динамику и взаимодействия клетка-клетка/клетка-окружающая среда. Здесь мы анализируем влияние различных характеристик потока как вычислительно, так и экспериментально на созревание церебральных органоидов и выявляем лучшую стратегию для разработки 3D-органоидов головного мозга, полученных из iPSC, на молекулярном, клеточном и функциональном уровнях. Микрофлюидная платформа (мк-платформа) обеспечивает гравитационный ламинарный поток, который имитирует поток жидкости, существующий в спинномозговом и интерстициальном пространствах, и усиливает межклеточные межклеточные взаимодействия, подачу кислорода и обмен питательных веществ и отходов7,23, что приводит к более длительному функционированию органоидов. Кроме того, необычно обеспечиваемые условия микрогравитации и ламинарного потока с помощью биореакторов горизонтально вращающейся системы культивирования клеток (RCCS) демонстрируют гомогенные гидродинамические силы, облегчающие долгосрочный точный контроль межклеточных взаимодействий и обеспечивающие высокую собираемость и воспроизводимость созревших церебральных органоидов. RCCS, вдохновленная чрезвычайными условиями космических технологий24, может стать уникальным инструментом в исследованиях органоидов благодаря уменьшению напряжения сдвига, увеличению массообмена и уменьшению повреждения клеток по сравнению с традиционными системами25. Мы предполагаем, что микрогравитация и ламинарные потоки, управляемые гравитацией, усиливают созревание церебральных органоидов, что приводит к созданию иерархически сложных пространственных сетей, повторяющих особенности эмбрионального развития коры головного мозга человека.

0.5, mostly for RCCS p = 0.9945). In spite of the low-velocity fields exercised in the RSSC and the µ-platform, nutrient mixing has been efficient to support organoid growth and low shear environment yielded homogeneous size distributions, which is of prime importance for multiplex testing in the pharmaceutical industry./p>40-day organoids with GABA polarity switch were regarded as indicators of progressive neuronal network maturation78. On the other hand, the glutamate level that was secreted from microglia was measured at around 20 µM in healthy in vitro neuronal cultures79,80. Given that, the change in the uptake and consequently release rate of extracellular glutamate in 60-day RCCS and µ-platform organoids and growth in organoid sizes might be associated with more mature states. One of the distinguishing features of neuronal circuits and maturation is the switch from excitatory to inhibitory GABAergic neurotransmission. GABA-A, a presynaptic GABAergic interneuron receptor that modulates neurotransmitter release in both peripheral and central synapses7,78,81,82,83, was more expressed in both RCCS and µ-platform organoids with CTIP2+ deep-layer of cortical neurons as of day 60 (Fig. 5a–c, Supplementary Fig. 2c). Thus, the neuronal network complexity was validated in RCCS and µ-platform organoids with the presence of both presynaptic glutamatergic VGLUT1+ and GABAergic GABA-A+ neurons, which are critically involved in neuronal network oscillations, as well as postsynaptic PSD95+ neurons, GFAP+/S100B+ astrocytes, and MBP+/OLIG2+ oligodendrocytes./p> 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n = 4 for independent replicates = 2). e The top five biological processes (Gene Ontology) and f tissue expression (tissues) enrichments of upregulated genes (Log2 transformation of fold regulation ≥1.9, p-value < 0.05, independent replicates = 2) of cerebral organoids matured in dynamic systems on day 120./p> 0.05, ****p < 0.0001) and e TUNEL apoptosis fluorescent staining images of sectioned organoids at days 60 and 120. DNAse-treated organoid section matured in the RCCS system is used as a control group. The DAPI-stained cell nucleus (blue), green fluorescent stained apoptotic zones in the cell nucleus (green), and white arrows indicate neural rosette-like structures (scale bars = 200 μm, independent replicates = 3, Zeiss Axio Vert.A1)./p> 0.05), the highest DNA breakage was observed in the shaker, where the organoids were exposed to the highest shear stress, whereas the lowest apoptotic signals were noted in µ-platform and RCCS organoids exposed to at least 100-fold less shear stress. Approaching day 120, the presence of apoptotic cells in the inner regions of the organoids cultured under static conditions dramatically increased to 89.6% ± 6.2 due to nutrient-oxygen deficiencies, as the organoid size increased91. Besides, the cellular damages in the peripheral regions of organoids matured in shaker and spinner cultures were observed to increase from day 60 to 120 (p < 0.0001, apoptotic zone of 73.8% ± 5.9 and 66.5% ± 6) due to uneven hemodynamic forces and higher shear stresses. On the other hand, the detection of few apoptotic cells in organoids cultured in µ-platform and RCCS yielded the highest survival rates with significantly lower apoptotic zones of 10.4% ± 4.2 and 16.5% ± 2.2, respectively. Consequently, organoids matured in dynamic systems showed more prominent cell viabilities by reduced cell deaths at the center of organoids with sufficient nutrient-gas supply and less cell apoptosis-induced organoid survival due to the effective agitation in different dynamic flow regimes compared to the static group6,92, mostly in the µ-platform12,93 and RCCS systems that provided complex cytoarchitecture in organoid maturation./p>95% harvestability. Although scale-up was not planned for this study, we presume that about 1000 matured organoids can be harvested in one batch, if we scale up to 500 ml RCCS STLVs, as such the µ-platform can be multiplied by connecting in a parallel or serial manner for scale-up purposes. This study suggests that RCCS and µ-platform organoids showing a high level of physiological fidelity can serve as functional preclinical models for testing new therapeutic regimens and benefit from multiplexing./p>350–400 µm./p> 0.05, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 were used. The Student's t-test was also used for qRT-PCR analyses (independent replicates = 2 with RNA isolate pool containing at least two organoids from the same batch). On the other hand, H&E, IF and TUNEL staining were made with three independent replicates using three individual organoids at different times, while WB analysis were carried out with two independent replicates using protein lysate pool from at least two organoids from the same batch./p>

Предыдущий: Моделирование значений перепада давления в ультра Следующий: Высокий

Отправить запрос

Отправлять